WB干货总结

科研中的经验都是要趟过无数坑，踩过无数雷才积攒下来的，Western Blot 是最常用的蛋白验证技术，今天我们为大家整理一些WB的经验谈。

1. 抗体

WB实验中抗体的选择是个令人头痛的问题，对比价格、种类和质量各位可以选择适合自己需求的品牌。首先介绍一下Sigma抗体：质量和价格成正比，一支100μl的flag抗体要9000RMB，真是贵到飞起，土豪首选。Abcam抗体：约3500一支，品种全，质量过硬，可以说是性价比之王了，然而100μl只给你90μl。CST：约2500一支，买100μl还送10μl，缺点是抗体种类太少。Santa:价格稍高于CST，多克隆抗体质量过关，单抗有Bug，购买需谨慎。国产抗体：价格便宜，质量参差不齐，WB能做出来的不多，而且杂带多，背景不干净，可以用来做一些免疫组化。

进口抗体国内分装：基本都是一次性产品，只有第一次好用，具体原因不详。

2. 内参

WB内参的选择也不容忽视，它关系到全盘实验的考评。常见的内参有Actin，Tubulin，GAPDH，最稳定的要属GAPDH，其它两个内参会容易出现复带。这也是为什么CNS上的文章几乎都用GAPDH作为内参。内参是WB实验中使用频率最高的抗体，每张膜都需要杂一次内参，算下来内参的费用十分惊人。

3. 封闭

一般我们采用脱脂奶粉或BSA封闭，BSA封闭可减少非特异性结合，但是容易封闭不均匀且性价比太低，质量好的脱脂奶粉封闭效果也不差。国产的奶粉脱脂不充分，会增加背景、拮抗抗原抗体结合，建议采用进口的脱脂奶粉。

4. 凝胶

3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris,Tris-Acetate.

Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，且保质期很短。在跑胶的过程中，PH还有上升的趋势，可达到9.5。容易导致蛋白降解和低分辨率。

Bis-Tris凝胶的PH为6.4，相对Tris-Glycine凝胶，稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂，比如DTT，以维持蛋白的还原性。

Tris-Acetate 凝胶的PH为7，跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。跑大分子蛋白时，我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。

另外目的蛋白分子量越大所需凝胶浓度应越低。

1. 凝胶电泳系统

目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad(伯乐)，尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上。Biorad的一套电泳系统价格在2万左右。

Bio-rad电泳系统（HIBIO）

2. 膜的选择

一般用到的膜有NC膜和PVDF膜，PVDF膜蛋白载量大，韧性好，蛋白吸附能力比NC膜强6倍，长时间电转也不会导致蛋白转过去，但价格比较贵，用之前需要用甲醇浸泡一分钟。NC 膜是国内很多实验室喜欢用的膜，不能用甲醇处理， NC 膜有时候会使结果背景非常高。

除了类别外，膜还有不同孔径大小的，一般有0.45μm和0.22μm，根据经验来说，20KD以下的蛋白采用0.22μm的膜就足够了。

3. 显影

大部分WB显色底物是化学发光底物，最后的显示方法有胶片(压片)法和化学发光成像系统。传统的压片过程存在很多弊端，操作繁琐且费时费力，浪费大量胶片。化学发光可以完成快速成像，无需暗室与胶片，无需显影与定影，目的条带不会因为曝光不足或者曝光过度而丢失，结果以电子文档呈现，便于定量分析。化学发光凝胶成像系统唯一不足是价格昂贵。

Bio-rad化学发光凝胶成像系统（HIBIO）

科研经费来之不易，一个失败的WB浪费的不仅仅是本次实验的时间和试剂，制备样品的成本也要加上去，如果使用的样本是动物组织或原代细胞那么失败的成本远比我们预想的要大得多。并且一次失败意味着我们将花费大量的时间和金钱去进行问题排除和优化条件。

总之，WB实验上根本省不下来钱，一个环节出现问题就会导致全盘失败。性价比最高的方法就是，用好货，注意每一个细节，让实验顺利完成。

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