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免疫荧光做不好? 来这里找答案免疫荧光做不好? 来这里找答案

发表时间:2018-01-25 14:32

一、基本原理

免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光素标记技术,是综合免疫学方法、荧光标记和显微镜技术的所建立的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体以化学的方法标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针与细胞或组织内相应的抗原(或抗体)结合形成荧光标记的抗体- 抗原复合物。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原(或抗体)的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。

二、应用范围

免疫荧光技术实验中一般多应用于特异蛋白抗原的检测所以又称它为荧光抗体技术,根据已知的抗体(或抗原)即可推知另一个未知抗原(或抗体)的存在。其应用范围极其广泛,可以测定细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、神经递质、受体、血药浓度等各种生物活性物质。

三、反应类型

  1. 直接免疫荧光法直接免疫荧光法是利用荧光色素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合,以鉴定未知抗原。本法具有操作简单、时程短、特异性高的优点,但也存在缺点如不能检查抗体,敏感性较差。

  2. 间接免疫荧光法:间接免疫荧光法以荧光素标记抗球蛋白抗体,抗体与相应抗原结合后,荧光标记的抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生作用,从而推知抗原或抗体的存在。间接荧光技术可以用已知的抗原检测未知的抗体,也可用已知的抗体测出未知抗原。


  3. 补体免疫荧光法:补体法是用特异性的抗体和补体的混合液与标本上的抗原反应,补体就结合在抗原抗体复合物上,再用抗补体的荧光抗体与之相结合,就形成了抗原—抗体—补体—抗补体荧光抗体的复合物。荧光显微镜下所见到的发出荧光的部分即是抗原所在的部位。补体法灵敏度高,适用于各种不同种属来源的特异性抗体的标记显示。


四、样本制备

  1. 涂片:血液、细菌培养物、脑脊液、细胞悬液等均可简单地涂抹在玻片上制备标本。

  2. 组织切片主要分为石蜡切片和冰冻切片:

    石蜡切片:是研究形态学的主要制片方法,优点是组织细胞形态结构清楚,缺点是对抗原的保存不如冷冻切片,有非特异性荧光。

    冰冻切片:其优点是操作简单,组织的抗原性保存好,自发荧光较少,特异荧光强,同时适用于不稳定的抗原,缺点是组织结构欠清晰。

  3. 活细胞爬片:将活细胞样本培养在玻璃片上,再进行固定和染色。细胞爬片时要注意细胞密度,玻璃片上应为单层细胞。

  4. 样本固定:可以终止细胞内酶反应过程,防止细胞自溶,以保持细胞固有形态和结构,保存组织细胞的抗原性。蛋白质类抗原如血清蛋白质和抗体,可用乙醇或甲醇固定;微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定;多糖类抗原用10% 福而马林固定。让抗体更易进入细胞与抗原结合,选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透一般可以用0.1%-0.2%Triton-X 100

五、荧光染色

封闭:

  1. 封闭液可以选择与二抗来源一致的血清,血清价格比较昂贵,可以用1%-5%BSA替代。

  2. 封闭时间不易过长,30-60min即可,且封闭后不用洗涤,直接加一抗孵育即可。

  3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。

染色:

  1. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。

  2. 染色时间:需要根据不同的标本及抗原而变化,一般室温2h,一抗4℃过夜效果更好。

  3. 染色温度:多采用室温25℃,高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用4℃的低温染色过夜。

  4. 荧光二抗使用前离心取上清使用,沉淀会在在片子上形成非特异性荧光光点,非常难看。

洗涤:

  1. 动作轻柔,固定后的细胞比较脆弱,很容易把细胞吹洗掉。

  2. 洗涤时间要把握好,每次洗涤5min左右。

  3. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合出现假阳性。

  4. 实验过程中切记样本要保持湿润,样本变干容易造成背景着色。

六、荧光观察

经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降,一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就开始有荧光减弱现象;

温度在20℃时,荧光素即开始表现温度淬灭作用。随温度升高,荧光淬灭作用就越强,可至荧光完全淬灭。温度在20℃以下,荧光素的荧光强度随温度的变化改变不明显,基本上保持恒量。因此,在适当的低温环境中进行荧光显微观察,可得到更好的效果。



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